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Seit Mitte der achtziger Jahre werden weltweit große Anstrengungen unternommen, neue Therapieformen zur Behandlung hereditärer neuromuskulärer Erkrankungen wie der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne zu entwickeln. Ausschlaggebend dafür waren die relative Häufigkeit und der Schweregrad der Erkrankung, sowie das Fehlen therapeutischer Alternativen (Sadoulet-Puccio & Kunkel, 1996; Koenig et al.,1989; Carpenter & Karpati, 1979; Emery, 1988; Worton, 1995). Die in der letzten Dekade erworbenen Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen haben zu einem verbesserten Verständnis der Pathogenese von Duchenne Muskeldystrophie beigetragen. Die Umsetzung dieser Erkenntnisse in neue klinische Behandlungsansätze stellt eine Herausforderung für die aktuelle klinische Forschung dar (Chakkalakal et al. 2005). Einer der derzeit favorisierten therapeutischen Ansätze ist die somatische Gentherapie (Karpati & Acskadi, 1993 und 1994). Dabei soll ein Gen mit Hilfe eines Vektorsystems in Zellen des Körpers eines Patienten eingebracht werden, um die Symptome einer Erkrankung zu lindern oder den Patienten zu heilen. Für die Therapie der Skelettmuskulatur kamen bisher am häufigsten virale Systeme zum Einsatz, bei denen das therapeutische Gen mit Hilfe eines replikationsdefizienten Adenovirus oder Adeno-assoziierten Virus übertragen wurde (Karpati und Lochmüller 1996, Acsadi et al., 1996; Monahan und Samulski 2000). Der zugrunde liegende Gendefekt und das Genprodukt (Dystrophin) sind gut charakterisiert, die Pathophysiologie kann auf den Gendefekt zurückgeführt werden und mehrere Tiermodelle stehen zur Verfügung (mdx-Maus, xmd-Hund), um die funktionellen Auswirkungen des Gentransfers zu untersuchen. Der Gendefekt ist lediglich Auslöser einer Kette an molekularen pathologischen Ereignissen, die dann eine Schädigung der Muskelzelle und damit die Erkrankung verursachen. Die mit Eintritt der Erkrankung einhergehende Umwandlung von Muskelgewebe in Fett- und Bindegewebe stellt einen wichtigen Bestandteil der Pathogenese von Muskeldystrophien dar (Engel & Franzini-Armstrong 1994). Dabei spielen zwei Vorgänge eine entscheidende Rolle: Zum einen werden Muskelproteine und Zellen verstärkt abgebaut und zum anderen Binde- und Fettgewebe vermehrt gebildet (Guttridge et al 2001; Liu et al. 2001). Eine besondere Rolle nimmt dabei das Zusammenspiel einer andauernden Entzündungsreaktionen, welche durch die Beseitigung beschädigter Muskelfasern im dystrophischen Muskel bedingt ist, und der Abnahme der Regenerationsfähigkeit des Muskelgewebes durch Muskelstammzellen ein (Gorospe et al., 1994; Porter et al., 2002; Negroni et al., 2005). Neuere Forschungsergebnisse legen nahe, dass die molekularen Signalketten, ausgelöst durch Entzündungsreaktion und Gewebeumbau, ebenfalls negative Auswirkungen auf die Regenerationskapazität von Muskelstammzellen haben (Liu et al., 2004).
Abbildung 1
Abbildung 1: Signaltransduktionswege, welche die terminale Differenzierung und Proliferation von Myoblasten regulieren. TGF-? und GDF-8 (Myostatin) Signaling in Myoblasten konvergieren in der Phosphorylierung von Smad3, welches die Regulation der Muskelzellproliferation über eine Induktion des Zellzyklusinhibitors p21, und die Differenzierung über eine direkte Interaktion mit MyoD hemmt. TNF-?/INF-? Signaling induizieren die Kerntranslokation von NF-KB and Expression von Cyclin D1, welche mit einer Abnahme der Expression von MyoD and Myogenin einhergeht (Liu et al., 2001; liu et al., 2004; Guttridge et al., 2000).
Ein Forschungsschwerpunkt des Labors für Molekulare Myologie stellt die Entwicklung rationaler therapeutischer Konzepte für den Eingriff in Signaltransduktionswege dar, welche Bestandteil der molekularen Pathogenese von Muskeldystrophien sind. Die aufgrund der Entzündungsreaktion veränderte Zytokinumgebung hat zum einen Auswirkungen auf die Differenzierungsfähigkeit der Satellitenzellen und zum anderen stimuliert sie die Genexpression für extrazelluläre Matrixproteine und fördern so den Gewebeumbau (Liu et al., 2004). Beide Signaltransduktionswege konvergieren in der Aktivierung von Smad3, einer Komponente der transforming growth factor beta (TGF-?) Signaltransduktionkaskade (Abbildung 1). Smad 3 erscheint somit als Schlüsselmolekül, welches an der Pathogenese des dystrophischen Muskels beteiligt sein könnte (Chen et al., 2005; Liu et al. 2004). Die Untersuchung der Funktion von TGF-? als Mediator für den Gewebeumbau soll daher im Tiermodell für Duchenne Muskeldystrophie, der mdx Maus, erfolgen.
Der Abbau von Muskelfasern und Muskelproteinen ist ein weiterer zentraler Mechanismus, der mit der dystrophischen Veränderung des Skelettmuskels einhergeht. Der Abbau von Proteinen erfolgt in der Zelle über das Proteasom. Proteine werden dabei durch kovalente Verknüpfung mit einer Kette von Ubiquitinproteinen für den Abbau durch das Proteasom gekennzeichnet (Polyubiquitinylierung). Die Polyubiquitinylierung wird durch Proteinkomplexe (E1-E4) katalysiert, welche durch ihre Vielfalt einen sowohl Zelltyp-spezifischen als auch Protein-spezifischen Abbau von Proteinen erlaubt. Neuere Forschungsergebnisse haben zur Identifikation einer Klasse von muskelspezifisch exprimierten E3/E4 Ubiquitin-Ligasen (Attaix et al., 2005; Glass et al. 2003). Eine weitere E3/E4 Ligase ist CHIP, welche beim Proteinabbau des Hauptbestandteils von Sarkomeren, Myosin, eine Rolle spielt Neuere Forschungsergebnisse haben zur Identifikation einer Klasse von muskelspezifisch exprimierten E3/E4 Ubiquitin-Ligasen geführt (Hoppe et al., 2005). Die Inhibition von CHIP im dystrophischen Wurmmodell führt zum Rescue des dystrophischen Phänotyps. Die Suppression der Aktivität von CHIP im Skelettmuskel und deren Auswirkung auf den Abbau von Muskelproteinen in vivo ist Gegenstand aktueller Forschung. Die Inhibition von CHIP und anderen muskelspezifischen E3 Ligasen und deren Auswirkung auf die Expression von Muskelproteinen kann sich auf misgefaltete Proteine auswirken und von therapeutischem Nutzen sein. So führt der Einsatz des generellen Proteasomeninhibitors MG-132 zur Reexpression von Dystrophin in mdx Mäusen (Bonuccelli et al., 2003). Mittels der RNA interference (RNAi) kann die Funktion der Proteine im zellulären Kontext untersucht werden. Die (RNAi) beruht auf der Fähigkeit von kurzen, doppelsträngigen RNA Molekülen (small interfering RNA (siRNA)) mit der Translation von Proteinen zu interferieren, indem die dazugehörige mRNA abgebaut wird (Fire et al., 1998). Die hier verwendete Adenovirus-basierte Expression von shRNAs ermöglicht es, hocheffizient einen Knockdown von Proteinen in sich differenzierenden primären Muskelzellen als auch in vivo zu erreichen. Die spezifische Inhibition des Proteasoms kann zu einer Reexpression von Proteinen führen, welche durch missense Punktmutationen anderenfalls abgebaut werden würden. Eine generelle Inhibition des Proteasom-Ubiquitin-Systems (UPS) ist mit schweren Nebenwirkungen verbunden, so dass eine spezifische, muskelspezifische Inhibition des UPS erwünscht ist. Die Inhibition von muskelspezifische E3 Ligasen ist Gegenstand aktueller Forschung.
Adenovirusvektoren sind in der Lage eine Vielzahl an humanen Zellen und Gewebe effizient zu transduzieren und eignen sich somit als „Genfähren“ für die Gentherapie. Adenoviren können zwar für den muskelspezifischen Gentransfer eingesetzt werden, werden aber von ausdifferenzierten Muskelfasern sehr ineffizient aufgenommen. Versuche in vivo haben gezeigt, dass eine Abnahme der Erreichbarkeit von Muskelfasern im adulten Skelettmuskel mit einer Abnahme des Adenovirus- Cocksackievirus-Rezeptors (CAR) korreliert (Nalbantoglu et al. 2001). Dementsprechend konnte die Transduktion von Skelettmuskeln im Tiermodell mit muskelspezifischer ‹berexpression von CAR drastisch verbessert werden. Ein weiterer Weg, um die Erreichbarkeit von Skelettmuskel zu verbessern, stellt die direkte Modifizierung des Virus dar. Der Einsatz von Oberflächen-modifizierten Adenoviren (Adenovirusretargeting) konnte die Transduktion von humanen Myotuben erheblich verbessern. Adenovirusvektoren können genetisch verändert werden, so dass Adenovirus Kapsidproteine verändert werden können.
Abbildung 2a
Abbildung 2a: Die Oberfläche von Adenoviren wurde genetisch so verändert, dass sie in der Lage ist Antikörper zu binden. Die Transduktion von primären humanen Myoblasten (FHM) erfolgt viel effizienter mit Antikörper-Adenoviruskomplexen, welche mit Antikörper gegen NCAM (5.1H11) und ? 7 Integrin (3C12) beladen sind. Eine Zunahme der ?-Galaktosidase Expression in transduzierten Zellen in blau korreliert mit einer zunehmender Antikörpermenge bei der Komplexbildung.
Die Insertion einer Antikörperbindedömäne in der HI loop des Adenovirus-Fiberproteins ermöglicht die Bildung von Adenovirus-Antikörper-Komplexen, welche die Bindung an neue Oberflächenmoleküle ermöglicht (Abbildung 2a; Volpers et al. 2003). Es existieren derzeit 51 humane Adenovirusserotypen, welche in 6 Untergruppen (A-F) eingeteilt werden. Der am häufigsten in der Gentherapie verwendete Adenovirus ist Ad5, ein subgroup C Virus. Die Verwendung von alternativen Serotypen erweist sich aufgrund der Immunogenität des Virus dann als besonders vorteilhaft, wenn eine weitere Gabe des Virus notwendig ist.
Abbildung 2b
Abbildung 2b: Vergleich der Transduktion von differenzierten, fusionierten humanen Myoblasten (Myotuben) mit zwei Adenovirus-Serotypvektoren, welche GFP exprimieren. Die Transduktion von Myotuben erfolgt effektiver mit dem Adenovirus-Serotypvektor Ad19aCMVGFP, wohingegen Ad5CMVGFP Myotuben von primären Affenzellen besser infiziert als humane Zellen. Dieser Versuch verdeutlicht Unterschiede zwischen Spezies, welche eine sorgfältige Auswahl des Zell- und Tiermodells für die Validierung molekularer viraler Therapien notwendig macht.
Alternative Adenovirusserotypen verwenden darüber hinaus andere Zellaufnahmemechanismen, welcher im Fall von Ad19a, einem subgroup D Virus, zu einer erheblich verbesserten Transduktion von Muskelzellen führt (Abbildung 2B; Thirion et al. 2006). Die Entwicklung von Adenovirusvektoren mit verbessertem Nebenwirkungsprofil und erhöhter Spezifität steht im Mittelpunkt der aktuellen Forschung.
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
aktion benni & co e.V. (Duchenne parents project, Deutschland)
Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)
Prof. George Karpati und Prof. Josephine Nalbantoglu, Montreal Neurological Institute (MNI), Montreal, Canada
Prof. Dr. Eckhard Wolf, Laboratory for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Genzentrum, München, Germany
Prof. Markus Ruegg, Biozentrum, Basel, Schweiz
Dr. Thorsten Hoppe, Zentrum für Molekulare Neurobiologie (ZMNH), Universität Hamburg, Germany
Das Labor ist Teil des Deutschen Muskeldystrophie-Netzwerks (MD-NET)
Dr. Christian Thirion
Prof. Dr. Hanns Lochmüller
