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Neue Erkenntnisse über die Auswirkungen verschiedener Mutationen in myofibrillären Genen auf die Protein-Assemblierung mittels konfokaler Einzelmolekülspektroskopie
Myofibrilläre Myopathien (MFM) sind eine Gruppe klinisch und genetisch heterogener Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Morphologisch werden sie durch anormale, intrazelluläre, desminpositive Proteinaggregate charakterisiert, die sich in den Muskelfasern befinden. Bei Desminopathien handelt es sich um eine genetisch definierte Subgruppe der Myofibrillären Myopathien, welche durch Mutationen im Desmin-Gen auf Chromosom 2q35 verursacht werden. Diese Erkrankungen wurden früher primäre Desminopathien oder Desmin-Aggregationsmyopathien genannt, da es zu einer Akkumulation von Desmin in den Muskelfasern kommt. Des Weiteren konnten in Patienten mit MFM Mutationen in anderen Genen identifiziert werden, die entweder für Komponenten der Z-Scheiben kodieren oder daran beteiligt sind, deren Struktur aufrecht zu erhalten: Myotilin (MYOT, TTID), ZASP (LDB3), Filamin C (FLNC) und alpha-B-Crystallin (CRYAB).
Die klinischen Phänotypen Myofibrillärer Myopathien, die durch Mutationen im Desmin-Gen verursacht werden, erstrecken sich über ein weites Spektrum. Innerhalb einer Familie treten scapuloperoneale, Gliedergürtel- und distal betonte Verteilungsmuster der Muskelschwäche auf mit variierender kardialer oder respiratorischer Beteiligung. Auch reine Kardiomyopathien sind bekannt. Die meisten Patienten zeigen ein autosomal-dominantes Vererbungsmuster. Es sind allerdings sowohl Patienten mit einer autosomal-rezessiven Vererbung, als auch Patienten ohne ersichtliche familiäre Vorgeschichte dokumentiert worden.
Desmin ist ein 53 kDa schweres, muskelspezifisches Intermediärfilament-Protein der Skelett-, Herz- und glatten Muskulatur. Es stellt eine wichtige, strukturelle Komponente der muskulären Zytoarchitektur dar und bildet ein drei-dimensionales Gerüst rund um die myofibrillären Z-Scheiben. Es verbindet den gesamten kontraktilen Apparat mit dem subsarcolemmalen Zytoskelett, dem Zellkern und anderen Organellen.
Das pathologische Merkmal Myofibrillärer Myopathien sind Desminaggregate in den Muskelfasern betroffener Patienten. Obwohl die meisten der bisher identifizierten krankheits-verursachenden Mutationen im Desmin-Gen ein Intermediärfilament-Gerüst bilden, wenn sie in vitro oder in Zellkultur analysiert werden, werden alle Mutationen mit der Bildung dieser Desminaggregate in Zusammenhang gebracht.
Auch wenn die Akkumulation von aggregiertem Desmin einen einheitlichen histopathologischen Befund darstellt, muss immer noch aufgeklärt werden, wie die verschiedenen, identifizierten Mutationen auf molekularer Ebene bei den betroffenen Patienten zu Fehlfunktionen der Muskelzellen führen. Ein besseres Verständnis dieser molekularen Signalwege könnte zu neuen Therapieansätzen führen, da bis heute nicht geklärt ist, ob eine Verbesserung der physiologischen Filamentbildung oder aber eine Reduktion der pathologischen Aggregate wichtiger ist, um eine normale Zellfunktion aufrecht zu erhalten. Die Tatsache, dass die Desmin-Assemblierung auf unterschiedliche Weise durch die einzelnen Mutationen beeinflusst wird und diese zu unterschiedlichen Phänotypen (z.B. vorwiegende Beteiligung der Skelettmuskulatur versus vorwiegende kardiale Beteiligung) führen, zeigt, dass verschiedene Signalwege vorhanden sein müssen.
Um die Desmin-Aggregation quantitativ auf Einzelmolekülebene zu analysieren, verwenden wir Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Fluorescence Intensity Distribution Analysis (FIDA) und Scanning for Intensely Fluorescent Targets (SIFT) in einem konfokalen Einzelmolekül-Detektionssystem. In den letzten Jahren stellte sich heraus, dass sich diese Messmethoden hervorragend dazu eignen, die Assemblierungs-Kinetiken fluoreszenzmarkierter Proteine in Echtzeit und die molekulare Zusammensetzung von Proteinaggregaten zu bestimmen. Des Weiteren können so viele Hochdurchsatz-Messungen mit kleinen Probenvolumina durchgeführt und neue Substanzen für Therapieansätze gefunden werden.
Abbildung 1
Abbildung 1: Confocal single molecule detection system
Diese Technik ermöglicht es, die veränderten Assemblierungseigenschaften der Desmin-Mutanten zu detektieren und deren Auswirkungen auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. Diese Effekte sind mittels klassischer Fluoreszenzmikroskopie nicht messbar. Mittels SIFT-Messungen werden Protein-Protein Interaktionen analysiert und die Effekte der pathogenen Mutationen charakterisiert. Der Einsatz dieser Technologie bietet die molekulare Basis für eine detaillierte funktionelle Klassifikation der Mutationen im Desmin-Gen und kann dazu beitragen, neue Diagnosemöglichkeiten und Therapieansätze zu entwickeln.
Dieses Forschungsprojekt (FOR 1228) wird durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.
Prof. Dr. Rolf Schröder, Erlangen, Deutschland
PD Dr. Christoph Clemen, Köln, Deutschland
Prof. Dr. Dieter Fürst, Bonn, Deutschland
Prof. Dr. Matthias Vorgerd, Bochum, Deutschland
PD Dr. Ludwig Eichinger, Köln, Deutschland
Prof. Dr. Harald Herrmann-Lerdon, Heidelberg, Deutschland
PD Dr. Benedikt Schoser, München, Deutschland
Prof. Dr. Gerhard Wiche, Wien, Österreich
Prof. Dr. Franz-Georg Hanisch, Köln, Deutschland
